NCSR Demokritos

Προσωπικό

Θωμαΐς Σουρλίγκα, Ερευνήτρια Β΄

Καλλιόπη Ε. Σέκερη, Ομότιμη Ερευνήτρια Α΄

Μάριος Ξυδούς, Μεταδιδακτορικός Συνεργάτης

Έλενα Κωστοπούλου, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια (Msc) – ολοκλήρωσε το 2012

Παρασκευή Σαλπέα, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια (PhD) – ολοκλήρωσε το 2011

Ιωάννης Νινιός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής (PhD) – ολοκλήρωσε το 2009

Ερευνητικά Ενδιαφέροντα του Εργαστηρίου

Αντικείμενο των μελετών του Εργαστηρίου είναι η μελέτη του ρόλου των

1) ιστονών και των υποτύπων των ιστονών,

2) επιγενετικών μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των ιστονών και

3) αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών

ΤΡΕΧΟΝTA ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΡΓΑ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

Γήρανση

Η αποφωσφορυλίωση των Η1.4 και Η1.5 υποτύπων της οικογένειας των Η1 ιστονών του συνδέτου DNA σχετίζεται με την αύξηση του σχηματισμού ετεροχρωματινικών περιοχών, δηλαδή μη ενεργής χρωματίνης, σε συνάρτηση με την αυξανόμενη ηλικία.

Εικόνα 1:  Διαχωρισμός των Η1 υποτύπων με Capillary Zone Electrophoresis (CZE) και εύρεση σημαντικής μείωσης της κορυφής 3  των διαχωρισμένων Η1 ιστονών σε λεμφοκύτταρα ηλικιωμένων δοτών σε σχέση με αυτών των νέων δοτών. Οι κορυφές ταυτοποιήθηκαν και βρέθηκε πως η κορυφή 3 αντιστοιχεί στις φωσφορυλιωμένες ισομορφές των Η1.4 και Η1.5 (pH1.4, pH1.5). Παράλληλα με ανοσοστύπωμα βρέθηκε αύξηση της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης, HP1α, στους ίδιους ηλικιωμένους δότες. Υ = νέοι, Μ = μεσήλικες,  S = ηλικιωμένοι, E = υπερήλικες. Ιστόνη Η3, πρωτεΐνη αναφοράς (Happel, N., Doenecke,D., Sekeri-Pataryas, K.E. and T.G. Sourlingas, Exp. Gerontol., 2008).

Η εργασία αυτή συνέδεσε για πρώτη φορά την αποφωσφορυλίωση δύο υποτύπων της Η1 ιστόνης με τον αυξημένο σχηματισμό ετεροχρωματινικών περιοχών κατά την γήρανση σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος ανθρώπου. Δεδομένου πως η φωσφορυλίωση – αποφωσφορυλίωση, καθώς και η παρουσία συγκεκριμένων Η1 υποτύπων, παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης και της γήρανσης (όπως υποδεικνύεται από την παρούσα εργασία)., θεωρούμε πως ο ετεροχρωματινισμός είναι μια αναγκαία διεργασία που λαμβάνει χώρα κατά την γήρανση λεμφοκυττάρων και οδηγεί στην σταδιακή αποσιώπηση γονιδίων τα οποία δεν είναι απολύτως αναγκαία για τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Αυτό αποσκοπεί στην εξοικονόμηση ενέργειας για την διατήρηση της επιβίωσης του γερασμένου φαινότυπου. Μελλοντική κατεύθυνση του συγκεκριμένου ερευνητικού έργου θα είναι η διερεύνηση του εάν το μετα-μεταφραστικό πρότυπο, τόσο της φωσφορυλίωσης, όσο και άλλων επιγενετικών τροποποιήσεων των ιστονών,  παίζει παρόμοιο ρόλο στο σχηματισμό ετεροχρωματίνης κατά την γήρανση και σε άλλα κυτταρικά / ιστικά συστήματα γήρανσης.

Απόπτωση

(1) Αποτελέσματα του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι ο παράγοντας κατακερματισμού του DNA (DFF40), ο οποίος ενεργοποιείται κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης, εντοπίζεται στην χρωματίνη, τόσο στην μη ενεργοποιημένη μορφή του (ως ετεροδιμερές με τον συνοδό του, DFF45), όσο και στην ενεργή του μορφή που προκύπτει  από την πρωτεόλυση του DFF45 μετά από αποπτωτικό ερέθισμα. Ήταν γνωστό ότι ο DFF40 αλληλεπιδρά με την Η1 ιστόνη του συνδέτου DNA, η οποία στρατολογεί τον DFF40 στις περιοχές του συνδέτου DNA, με αποτέλεσμα να κατακερματίζει το DNA μόνο στις περιοχές μεταξύ των νουκλεοσωμάτων σε in vitro συστήματα . Όμως δεν ήταν γνωστό αν ο παράγοντας αυτός αλληλεπιδρά επιλεκτικά με συγκεκριμένους υποτύπους της Η1 τάξης των ιστονών. Η ερευνά μας σε αυτόν τον τομέα έδειξε πως ο DFF40, αν και αλληλεπιδρά με όλους τους υποτύπους της Η1, εμφανίζει αυξημένη αλληλεπίδραση με τις Η1.5 και Η1.0, και μειωμένη αλληλεπίδραση με την Η1.3.

Εικόνα 2:  Σχετική σύσταση των Η1 υποτύπων  (Η1.1, Η1.3, Η1.5 και Η1.0) στην χρωματίνη (Α) και  ποσοτικοποίηση των Η1 υποτύπων μετά από συν-ανοσοκατακρήμνιση (co-IP, co-immunoprecipitation) με τον DFF40 στο χρωματινικό κλάσμα των ΝΒ4 λευχαιμικών κυττάρων  (Β). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η αναλογία του κάθε H1 υποτύπου σε σχέση με το ολικό κλάσμα της Η1 τάξης. TSA, τριχοστατίνη Α (αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών), αποπτωτικό ερέθισμα (Ninios, Y.P., Sekeri-Pataryas, K.E. and T.G. Sourlingas, Apoptosis, 2010).

Τα αποτελέσματα αυτά είναι σημαντικά γιατί για πρώτη φορά μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του DFF40 με συγκεκριμένους Η1 υποτύπους σε ένα in vivo καρκινικό κυτταρικό σύστημα, την προμυελοκυτταρική λευχαιμική κυτταρική σειρά, ΝΒ4 και με έναν εξωγενές αποπτωτικό ερέθισμα. Περαιτέρω έρευνα με έναν μεγαλύτερο αριθμό καρκινικών σειρών και με άλλα αποπτωτικά μέσα θα δείξει αν η επιλεκτική αλληλεπίδραση του DFF40 με συγκεκριμένους υποτύπους της Η1 εξαρτάται από το είδος του καρκίνου ή/και το αποπτωτικό μέσο.

(2) Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών, τριχοστατινη Α (TSA), που προκαλεί την συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών καθώς και ορισμένων μη ιστονικών πρωτεϊνών (όπως η α-τουμπουλίνη), ενώ ταυτόχρονα δρα ως έναν αποπτωτικό μέσο, σε τέσσερις λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, διαπιστώσαμε πως ο βαθμός ακετυλίωσης αντανακλά τον βαθμό απόπτωσης της εκάστοτε λευχαιμικής σειράς. Το εύρημα αυτό είναι σημαντικό γιατί, αν και ήταν γνωστό ότι η ακετυλίωση σχετίζεται με την απόπτωση, όταν το αποπτωτικό ερέθισμα είναι ένας αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, δεν ήταν γνωστό κατά πόσο μια ανθεκτική στον αναστολέα κυτταρική σειρά, που δηλαδή δεν οδηγείται σε απόπτωση, θα εμφάνιζε αυξημένη ακετυλίωση. Βρήκαμε πως η κυτταρική σειρά K562, στην οποία η TSA δεν μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση, δεν παρουσίασε αλλαγές στα επίπεδα ακετυλίωσης τόσο σε ιστόνες όσο και στην α-τουμπουλίνη. Το συμπέρασμα είναι πως η συσσώρευση ακετυλιωμένων υποστρωμάτων ενδέχεται να είναι μια αναγκαία προϋπόθεση για την έναρξη και ολοκλήρωση της αποπτωτικής διαδικασίας. Δεδομένης της ευρείας χρήσης αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών σε αντικαρκινικά σχήματα, μόνων τους ή σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά μέσα, σε κλινικό επίπεδο τα αποτελέσματα αυτά ενδέχεται να αναδείξουν τα επίπεδα ακετυλίωσης ως ένα επιπλέον βιοδείκτη για την αποτελεσματικότητα αντικαρκινικών σχημάτων όπου χρησιμοποιούνται αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών.

Εικόνα 3: Βαθμός ακετυλίωσης της ιστόνης Η4 μετά από ηλεκτροφόρηση οξικού οξέος/ ουρίας/tritonX-100 (AUT gel) και βαθμός απόπτωσης μετά από ανοσοστύπωμα για την ανίχνευση των επιπέδων πρωτεόλυσης του PARP. TSA, τριχοστατίνη Α. H4.0, Η4.1, Η4.2, Η4.3 και Η4.5, μη- μονο-, δι-, τρι- και τετρα-ακετυλιωμένες ισομορφές της ιστόνης Η4, αντίστοιχα (Ninios, Y.P., Sekeri-Pataryas, K.E. and T.G. Sourlingas, Leukemia Res., 2009). 

Η TSA είναι ένας εξειδικευμένος και ισχυρός αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών που υπήρξε, και θα συνεχίσει να είναι, ένα πολύτιμο εργαλείο σε πειραματικές ερευνητικές μελέτες. Όμως δεν χρησιμοποιείται κλινικά. Μελλοντικός στόχος αυτού του έργου είναι η διερεύνηση, σε ένα ευρύτερο φάσμα καρκινικών συστημάτων και με  άλλους αναστολείς των αποακετυλασών που να είναι σε προ-κλινικό ή ακόμη και σε κλινικό στάδιο, του κατά πόσο τα επίπεδα ακετυλίωσης πρωτεϊνών αντανακλούν αξιόπιστα την αποδοτικότητα των συγκεκριμένων μέσων ως προς την ικανότητά τους να επάγουν απόπτωση και συνεπώς τα επίπεδα ακετυλίωσης να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως επιπλέον βιοδείκτες του βαθμού απόπτωσης καρκινικών κυττάρων.

Βιολογικό Ρολόι

Μελετήσαμε την επίδραση στη λειτουργία του βιολογικού ρολογιού του νικοτιναμιδίου και της τριχοστατίνης Α, που αποτελούν αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών  σε ΝΙΗ3Τ3 καλλιέργειες κυττάρων (αθανατοποιημένοι ινοβλάστες ποντικού). Με qPCR βρέθηκε ότι η τριχοστατίνη Α αυξάνει τα επίπεδα mRNA του πρώιμου γονιδίου του ρολογιού per1 (period1), ενώ το νικοτιναμίδιο καταστέλλει τη δράση της τριχοστατίνης Α. Επιπλέον, το νικοτιναμίδιο εμποδίζει την επαγωγή της οξείας απόκρισης του per1 από τη δεξαμεθαζόνη, η οποία είναι απαραίτητη για το συγχρονισμό του κιρκαδικού ρολογιού στις καλλιέργειες. Και στις δύο περιπτώσεις (TSA, δεξαμεθαζόνη), το νικοτιναμίδιο ασκεί την κατασταλτική του δράση με μηχανισμό που δεν σχετίζεται άμεσα με την ικανότητά του να αναστέλλει τις αποακετυλάσες των ιστονών της τρίτης τάξης (sirtuins), καθώς η χρήση ενός εναλλακτικού αναστολέα αυτών των ενζύμων δεν οδήγησε σε καταστολή της επαγωγής του per1. Πειράματα ανοσοκατακρήμνινης χρωματίνης (ChIP) έδειξαν πως η αναστολή της οξείας απόκρισης,  καθώς και της προκαλούμενης αύξησης των επιπέδων mRNA από την TSA, συνοδεύεται από πτώση των επιπέδων τριμεθυλίωσης της λυσίνης 4 της ιστόνης Η3 (Η3Κ4me3) στον υποκινητή του γονιδίου.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την ύπαρξη ενός νέου μηχανισμού ρύθμισης της λειτουργίας του βιολογικού ρολογιού. Μελλοντικός στόχος αυτού του έργου είναι να διερευνηθεί αν οι μηχανισμοί με τους οποίους το νικοτιναμίδιο μειώνει τα επίπεδα Η3Κ4me3 σχετίζονται με αλλαγές στην ενεργότητα  των μεθυλασών  ή των απομεθυλασών. Πέρα από την προσθήκη νέας πληροφορίας στο πεδίο μελέτης της γονιδιακής ρύθμισης, η αποσαφήνιση του μοριακού υποβάθρου αυτού του νέου μηχανισμού ενδεχομένως να είναι σημαντική για την ανθρώπινη διατροφή και την κτηνοτροφία, καθώς το νικοτιναμίδιο χρησιμοποιείται ευρέως ως διατροφικό συμπλήρωμα  (είναι το αμίδιο της βιταμίνης.Β3).