Εργαστήριο Εξωσωμικής ανάλυσης & Παθολογίας εγκεφάλου -  ExoBrain

Στην νέα εποχή της Ιατρικής Ακρίβειας (Precision Medicine), η διάγνωση, η πρόγνωση αλλά και η θεραπεία πολύπλοκων και πολυπαραγοντικών ασθενειών του εγκεφάλου όπως η νόσος Αλτσχάιμερ (NA) και η κατάθλιψη, στηρίζονται όλο και περισσότερο στην συνεκτίμηση παραγόντων κινδύνου, τρόπου ζωής και πολυεπίπεδων βιολογικών αναλύσεων που προσπαθούν να αποτυπώσουν την βαθμό της παθολογίας του εγκεφάλου αλλά και την αποτελεσματικότητα νέων θεραπευτικών μορίων σε κάθε ασθενή.

Το εργαστήριο «Εξωσωμικής ανάλυσης και Παθολογίας εγκεφάλου - ExoBrain» με επικεφαλή τον Δρ. Ιωάννη Σωτηρόπουλο επικεντρώνεται στην μελέτη διάφορων κυτταρικών μηχανισμών στην ΝΑ (π.χ. Αβ, Τau, φλεγμονή) και τη σχέση τους με τα εξωσώματα του εγκεφάλου. Τα εξωσώματα (exosomes)  είναι μικρά εξωκυτταρικά κυστίδια (extracellular vesicles - EVs) που εκκρίνονται από τα κύτταρα και μεταφέρουν πρωτεΐνες, RNA και DNA του κυττάρου προέλευσης. Με αυτό τον τρόπο, τα εξωσώματα φαίνεται από την μια, να συμμετέχουν στην εξάπλωση της παθολογίας της ΝΑ ανάμεσα στα κύτταρο & περιοχές του εγκεφάλου ενώ από την άλλη, να αποτελούν μεταφορείς «δεικτών» της παθολογίας του εγκεφάλου και άρα πιθανούς βιοδείκτες που μπορούν να συλλεχθούν στο περιφερειακό αίμα (Gomes et al., Exper Neurol 2022; Gomes et al., Cell Com 2023) (βλέπε Εικόνα/Figure 1). Το εργαστήριο μας χρησιμοποιεί νέες τεχνικές συλλογής, απομόνωσης και πολυεπίπεδης ανάλυσης εξωσωμάτων του εγκεφάλου αλλά και εξωσωμάτων του περιφερειακού αίματος εγκεφαλικής προέλευσης με δυνατότητα διαχωρισμού κυτταρικού τύπου (πχ, νευρωνικά εξωσώματα) ενώ έχει αναπτύξει δική του μέθοδο απομόνωσης εξωσωμάτων εγκεφάλου (release method) (Gomes et al., Cell Com 2023).

Οι ερευνητικές κατευθύνσεις της ομάδας του Δρ Σωτηρόπουλου περιλαμβάνουν:

1) την μελέτη των αιτιοπαθολογικών μηχανισμών που συνδέουν το στρες με την ΝΑ και την κατάθλιψη,

2) την δοκιμή νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων (π.χ. αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια- ASOs),

3) διερεύνηση της πιθανής χρήσης των εξωσωμάτων ως βιοδείκτες.

Συνδυάζοντας μελέτες σε κυτταρικά και ζωικά μοντέλα αλλά και ανθρώπους, ένα μεγάλο μέρος των ερευνητικών προσπαθειών του εργαστηρίου επικεντρώνεται στην κυτταρική κατανόηση της δράσης παραγόντων κινδύνου της ΝΑ και της κατάθλιψης, όπως το χρόνιο ψυχολογικό στρες, καθώς εμφανίζεται μια αιτιοπαθολογική σχέση ανάμεσα στην κατάθλιψη και την ΝΑ, με το χρόνιο στρες να προτείνεται ως ο συνδετικός παράγοντας ανάμεσα στις δυο ασθένιες (Sotiropoulos et al., 2019; Dioli et al., 2023) (Εικόνα-Figure 2). Πιο συγκεκριμένα, μελέτες μας έχουν δείξει ότι το χρόνιο στρες ενεργοποιεί τους παθολογικούς μηχανισμούς της ΝΑ (π.χ. υπερπαραγωγή του αμυλοειδούς βήτα (Αβ) και συσσώρευση την υπερφωσφωρυλίωμενης πρωτεΐνης Τau) οδηγώντας σε νευρωνική δυσλειτουργία και ατροφία, απώλεια μνήμης και διαταραχές διάθεσης (Monteiro-Fernandes et al., Mol Psych 2022; Sotiropoulos et al., J Neurosc 2011; Lopes et al. PNAS 2016; Vaz-Silva et al., EMBO 2018). Επιπρόσθετα, περιγράψαμε κυτταρικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων το χρόνιο στρες οδηγεί σε συσσώρευση παθολογικών μορφών της πρωτεΐνης Tau όπως η δυσλειτουργία μηχανισμών αποδόμησης πρωτεϊνών (π.χ. το ενδολυσσοσωμικό μονοπάτι και η αυτοφαγία), οδηγώντας σε απορρύθμιση πρωτεϊνών που συνδέονται στο RNA και το σχηματισμό RNA κοκκίων (Stress granules; Vaz-Silva et al, EMBO 2018; Silva et al, Cell Death & Diff 2019) αλλά και σε έκκριση εξωσωμάτων (Gomes et al., Cell Com 2023).

Ένα άλλο κομμάτι της δουλείας μας καταδεικνύει νέους κυτταρικους μηχανισμούς που σχετίζονται με την Tau και εμπλέκονται στην επιβλαβή δράση του χρόνιου στρες στην πλαστικότητα του ενήλικου εγκεφάλου. Συγκεκριμένα, προτείνουμε στρεσσοεπαγόμενους μηχανισμούς συναπτικής δυσλειτουργίας μέσω της παθολογικής συσσώρευσης της Tau στη σύναψη που οδηγεί σε απορρύθμιση της σηματοδότησης του γλουταματεργικού υποδοχέα (Lopes et al. PNAS 2016; Pinheiro et al., Mol Neurobiol 2016) αλλά των απορρύθμιση συναπτικών μιτοχονδρίων (Lopes et al. Cer Cortex 2016). Επίσςη, το χρόνιο στρες μειώνει την νευρογένεση στον ενήλικο εγκέφαλο στον ιππόκαμπο και στην υποεπενδυματική ζώνη του εγκεφάλου μέσω της συσσώρευσης υπερφωσφορυλιωμένης 4R-Tau ισομορφής σε νεογέννητα νευρικά κύτταρα (Dioli et al. Mol Psychiatry 2017; Trans Psych 2019; Cell Diff 2021).

Επιπρόσθετα, σε συνεργασία με διάφορα ερευνητικά ιδρύματα και την φαρμακοβιομηχανία σε Ελλάδα και εξωτερικό, η ερευνητική δουλειά του εργαστηρίου μας επίσης περιλαμβάνει τον έλεγχο των πιθανών θεραπευτικών ή προστατευτικών δράσεων ενάντια στην στρεσσοεπαγόμενη κατάθλιψης και της ΝΑ ελέγχοντας νέα μόρια και ουσίες π.χ. αντινοηματικά νουκλεοτίδια (Antisense oligonucleotides-ASOs), μικρονευροτροφίνες, κανναβιδιόλη (CBD) και ψυχεδελικές ουσίες (Εικόνα-Figure 2).

Μια άλλη ερευνητική δραστηριότητα του εργαστηρίου υπό την καθοδήγηση της Δρ. Ζαφειρούλας (Ηρούς) Γεωργούση εστιάζεται στην διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη ρύθμιση της οικογένειας των υποδοχέων που συζευγνύονται με G πρωτεΐνες (GPCRs) χρησιμοποιώντας ως μοντέλο σύστημα τους οπιοειδείς υποδοχείς. Οι υποδοχείς αυτοί εμπλέκονται στην αντίληψη του πόνου και στις υποκείμενες παρενέργειες της ανοχής και της εξάρτησης μετά από παρατεταμένη χρήση ναρκωτικών ουσιών ενώ ρυθμίζουν επίσης συναισθηματικές αποκρίσεις και επηρεάζουν λειτουργίες που σχετίζονται με το στρες, τη φλεγμονή και τη νευρογένεση (Birgül Iyison et al., 2024).

Αντίστοιχα, η Δρ Η. Γεωργούση επιχειρεί να διευκρινίσει:

α) πώς καθορίζεται η κατεύθυνση σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων,

β) ποιες πρωτεΐνες, εκτός των G πρωτεϊνών ρυθμίζουν την πλαστικότητα των νευρώνων στο ΚΝΣ και

γ) ποια είναι τα υπεύθυνα σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκονται.

Σε αυτό το πλαίσιο, η ομάδα της προσδιόρισε ότι οι διαφορετικοί υποτύποι των οπιοειδών υποδοχέων μ, δ και κ, χρησιμοποιούν τον ίδιο μηχανισμό σηματοδότησης για να επιφέρουν διακριτές και πολύπλοκες φυσιολογικές αποκρίσεις όπως η διαφοροποίηση των νευρώνων και η νευριτική ανάπτυξη αλληλεπιδρώντας με πρωτεΐνες των οποίων η λειτουργία μεταβάλλεται μετά τη χορήγηση οπιοειδών (Georgoussi et al., 2006; 2012; Leontiadis et al., 2009, Fourla et al., 2012, Georganta et al., 2010; 2013, Papakonstantinou et al., 2015; Pallaki et al., 2017; Karoussiotis et al., 2020).

Η ομάδα της Δρ Γεωργούση έδειξε επίσης πώς οι αλλαγές στη σηματοδότηση των οπιοειδών υποδοχέων οδηγούν σε διακριτές κυτταρικές αποκρίσεις και ότι τα οπιοειδή εμπλέκονται σε συμπεριφορές που σχετίζονται με το άγχος και το στρες. Προσδιορίστηκε ενα νέo σηματοδοτικό μονοπάτι  που επάγει τον μηχανισμό της αυτοφαγίας και τις επακόλουθες συναπτικές αλλοιώσεις στον εγκέφαλο κατά την ενεργοποίηση του κ-οπιοειδούς υποδοχέα  (κ-ΟR) με επιλεκτικούς αγωνιστές.  Επιπλέον έδειξε ότι το στρες επάγει την εξαρτώμενη από κ-OR αυτοφαγία που οδηγεί σε νευρωνικές και συναπτικές αλλοιώσεις σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, οι οποίες αναστρέφονται με τη χορήγηση ειδικών ανταγωνιστών του κ-OR με υψηλή κλινική σημασία (Karoussiotis et al., 2022) (Εικόνα-Figure 3).

Σήμερα, οι βασικοί στόχοι της Δρος Γεωργούση επικεντρώνονται: i) στον προσδιορισμό του ρόλου της πρωτεΐνης RGS4 στην επαγωγή της αυτοφαγίας και της συναπτικής πλαστικότητας κατά την ενεργοποίηση του κ-OR, καθώς και ii) στη διαλεύκανση του μηχανισμού μέσω του οποίου οπιοειδείς προσδέτες μεσολαβούν σε διαφορετικούς οδούς σηματοδότησης, καθορίζοντας την συσχέτιση μεταξύ της αυτοφαγίας και των συμπεριφορών άγχους και κατάθλιψης που ρυθμίζονται από τον κ-OR (Εικόνα-Figure 3). Ταυτόχρονα, ο φαρμακολογικός χαρακτηρισμός βιοδραστικών ενώσεων από την ελληνική χλωρίδα σε κυτταρικά συστήματα αναφοράς ικανών να ρυθμίζουν τη δράση των οπιοειδών και άλλων GPCR, βρίσκεται σε εξέλιξη στο πλαίσιο της ανάπτυξης συμπληρωμάτων διατροφής που μπορεί να ανακουφίσουν τον πόνο ή τις διαταραχές της διάθεσης.

Επιπλέον, υπό την καθοδήγηση του Καθ. Κώστα Ιατρού, μια άλλη ερευνητική κατεύθυνση του εργαστήριου εστιάζει στη μελέτη των οσφρητικών υποδοχέων των κουνουπιών και άλλων αιματοφάγων εντόμων. Η δραστηριότητα αυτή στοχεύει σε παρεμβάσεις που περιορίζουν την ικανότητα εντόμων-φορέων λοιμωδών νόσων (ΕΦΛΝ) να μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες σε ζώα και ανθρώπους ως συνέπεια της απομύζησης αίματος από αυτούς. Mια αποτελεσματική μέθοδος για τον έλεγχο της συμπεριφοράς των ΕΦΛΝ είναι η χρήση περιβαλλοντικά ασφαλών ουσιών που μπορούν να τροποποιούν την οσφρητική ικανότητα των εντόμων και να επάγουν ανοσμία σε αυτά, μειώνοντας με αυτό τον τρόπο δραστικά την ικανότητα των εντόμων να ανιχνεύουν ξενιστές για απομύζηση αίματος και μετάδοση παθογόνων σε αυτούς.

Xρησιμοποιώντας ως μοντέλο το κουνούπι-φορέα της ελονοσίας Anopheles gambiae, οι μελέτες του Δρ Ιατρού εστιάζονται στην ανακάλυψη πτητικών οργανικών ενώσεων (volatile organic compounds, VOCs) φυσικής προέλευσης, που προκαλούν συμπτώματα ανοσμίας σε κουνούπια και σε άλλα αιματοφάγα έντομα. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της παρεμπόδισης της λειτουργίας του κοινού για όλους τους οσφρητικούς υποδοχείς οσφρητικού συν-υποδοχέα ORco, ο οποίος είναι απαραίτητος για την λειτουργικότητα όλων των οσφρητικών υποδοχέων. Συγκεκριμένα, οι μελέτες επικεντρώνονται στην ανακάλυψη φυσικών μικρομορίων που προσδένονται στον ORco και δρουν ως ανταγωνιστές του και, κατά συνέπεια, ως ανταγωνιστές πρακτικά όλων των οσφρητικών υποδοχέων (Εικόνα-Figure 4). Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας κυτταρικής πλατφόρμας έκφρασης του ORco και μέτρησης της ενεργότητας του ex vivo μέσω μιας συνεκφραζόμενης φωτοπρωτεΐνης αναφοράς. Ταυτόχρονα επιχειρείται η έκφραση και απομόνωση ανασυνδυασμένου ORco σε μεγάλη κλίμακα προκειμένου να προσδιοριστεί η τεταρτοταγής δομή του ORco και να καταστεί δυνατή η εκλογικευμένη ανακάλυψη νέων πτητικών μικρομορίων που προκαλούν την αναστολή της λειτουργίας του. Μεθοδολογίες τεχνητής νοημοσύνης για την επίτευξη του ίδιου στόχου με βάση τις δομικές ιδιότητες των βιοενεργών VOCs είναι επίσης σε εξέλιξη (ενδεικτικές δημοσιεύσεις:Tsitoura & Iatrou, Front Cell Neurosci 2016; Thireou et al, Insect Biochem Mol Biol 2018; Kythreoti et al, J Biol Chem 2021).