NCSR Demokritos

Βίκυ Σοφιανοπούλου, Ερευνήτρια A΄

Χρήστος Γουρνάς: Ερευνητής Γ΄

Αλέξανδρος Αθανασόπουλος: Μεταπτυχιακός Φοιτητής, Υποψήφιος Διδάκτορας

Άντα Μπιράτση: Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια, Υποψήφια Διδάκτορας

Ειρήνη Παπανικολάου: Διπλωματική Φοιτήτρια

Γεωργία Άννα Αγγελίδη: Φοιτήτρια Πρακτικής Άσκησης

 

Ερευνητικά ενδιαφέροντα:

Τα κύρια ερευνητικά ενδιαφέροντα του εργαστηρίου αφορούν: 1) τη ρύθμιση της έκφρασης, τους μοριακούς μηχανισμούς λειτουργίας, την κυτταρική βιολογία και την εξέλιξη διαμεμβρανικών πρωτεϊνών μεταφοράς αμινοξέων και 2) την πλευρική οργάνωση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης των μυκήτων. Ο πρότυπος οργανισμός που έχουμε επιλέξει για τις μελέτες μας είναι ο ασκομύκητας Aspergillus nidulans, ένα κλασικό πρότυπο βιολογικό σύστημα μελέτης από το 1950. Δύο μεταφορείς αμινοξέων του A. nidulans έχουν κλωνοποιηθεί και μελετηθεί λεπτομερώς σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και κυτταρικό επίπεδο. Επιπλέον εισαγάγαμε τον A. nidulans ως πρότυπο σύστημα μελέτης της ετερόλογης έκφρασης και λειτουργικού χαρακτηρισμού μεταφορέων από άλλους οργανισμούς (Argyrou et al. 2001). Παράλληλα, τα τελευταία χρόνια μελετάμε τη διαμερισματοποίηση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης του A. nidulans και πώς αυτή εμπλέκεται σε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες. Πιο συγκεκριμένα έχουμε επικεντρωθεί στα «εισοσώματα», στατικά υπομεμβρανικά διαμερίσματα που δημιουργούν αυλακοειδείς νανο-εγκολπώσεις στην πλασματική μεμβράνη συγκεκριμένης σύστασης σε λιπίδια και πρωτεΐνες και στη συσχέτισή τους κυρίως με τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων και το οξειδωτικό στρες.

Ο νηματοειδής ασκομύκητας Aspergillus nidulans.

 

Α. Χρήση πρότυπων ευκαρυωτικών μικροοργανισμών για την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας διαμεμβρανικών μεταφορέων αμινοξέων που σχετίζονται με παθολογικές ή εκφυλιστικές καταστάσεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος

Κατά ένα σύγχρονο ορισμό της έννοιας της ανθρώπινης ασθένειας, ασθένεια προκύπτει από διάσπαση του δικτύου επικοινωνίας και συντονισμού μεταξύ των κυττάρων ενός πολυκύτταρου οργανισμού που μπορεί να οφείλεται σε λοίμωξη, γενετική μεταλλαγή, χημική προσβολή ή τραυματισμό. Κεντρικό ρόλο στη λειτουργία αυτού του δικτύου κυτταρικής επικοινωνίας έχουν οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (μεταφορείς και κανάλια) που διαμεσολαβούν στην κυτταρική πρόσληψη και εκροή μεταβολιτών, οργανικών ουσιών και φαρμάκων. Οι μεταφορείς έχουν εμπλακεί στη διάγνωση ή θεραπευτική αντιμετώπιση περισσότερων από 60 ανθρώπινων γενετικών ασθενειών (π.χ. κυστική ίνωση, διαταραχές νευροδιαβίβασης, διαβήτης, εγκεφαλική συμφόρηση), στη διαχείριση χημειοθεραπευτικών και άλλων φαρμάκων από τον οργανισμό (π.χ. πρωτεΐνες πολυφαρμακευτικής αντίστασης, MDR) και στη στόχευση μερικών από τα ευρύτερα χρησιμοποιούμενα φάρμακα (π.χ. Prozac).

Παρά τη σπουδαιότητα τους, η κυτταρική ρύθμιση της έκφρασης διαμεμβρανικών μεταφορέων και οι σχέσεις δομής-λειτουργίας που καθορίζουν τη λειτουργία και εξειδίκευσή τους παραμένουν ελάχιστα γνωστές. Επιπλέον, η υψηλή υδροφοβικότητα των πρωτεϊνών αυτών καθιστά δύσκολη την κρυστάλλωσή τους και κατ΄ επέκταση την αποκάλυψη των δυναμικών διαμορφώσεων που λαμβάνουν κατά τη διάρκεια του κύκλου μεταφοράς.

Μια εναλλακτική προσέγγιση της κατανόησης των σχέσεων δομής-λειτουργίας των καναλιών και των μεταφορέων είναι η ανάλυση της λειτουργίας μεταλλαγμένων ή τροποποιημένων εκδοχών τους σε εύκολα διαχειριζόμενα βιολογικά συστήματα. Μοναδικό παράδειγμα αποτελεί η μελέτη του μεταφορέα της λακτόζης (LacY) του βακτηρίου της Escherichia coli από την ομάδα του R. Kaback. Στην περίπτωση αυτή, αποκλειστικά μέσω βιοχημικών και βιοφυσικών προσεγγίσεων, της ανάλυσης μεταλλαγμένων μεταφορέων και της ανάπτυξης της τεχνικής σάρωσης κυστεϊνικής μεταλλαξιγένεσης, προτάθηκε ένα μοντέλο για το πώς λειτουργεί ο μεταφορέας LacY, πριν ακόμα επιτευχθεί η κρυστάλλωση του, το οποίο επιβεβαίωσε σε γενικές γραμμές τα ευρήματα (Sorgen et al., 2002; Guan L. and Kaback HR, 2006; Abramson et al. 2003, Science).

Η συμβολή του εργαστηρίου μας προς την κατεύθυνση αυτή αφορά τη χρήση κλασικής και αντίστροφης γενετικής, τη σάρωση με μεταλλαξιγένεση κυστεϊνικών καταλοίπων, τη μοριακή δυναμική (molecular dynamics), μοντελοποίηση (molecular modeling) και induced-fit προσεγγίσεις για την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας δύο διαμεμβρανικών μεταφορέων ΥΑΤ (Yeast Amino acid Transporters) της υπεροικογένειας APC (Amino acid-Polyamine-OrganoCation). Πρόκειται για τον κύριο μεταφορέα προλίνης PrnB (Tavoularis et al. 2001, 2003; Kafasla et al. 2007; Vangelatos et al. 2009) και το μεταφορέα γλουταμικού/ασπαρτικού AgtA (A. Apostolaki et al. 2009) του A. nidulans. Στην περίπτωση του PrnB, χρησιμοποιώντας δομική συστοίχιση και μοντελοποίηση, δείξαμε ότι η προβλεπόμενη δομή μελών της οικογένειας APC είναι εξαιρετικά παρόμοια με τις κρυσταλλικές δομές ενός σημαντικού αριθμού βακτηριακών μεταφορέων που ανήκουν σε εξελικτικά διακριτές πρωτεϊνικές οικογένειες με διαφορετικές εξειδικεύσεις υποστρωμάτων. Όλοι αυτοί οι μεταφορείς, αν και δεν παρουσιάζουν εμφανή ομοιότητα αμινοξικής αλληλουχίας, εμπίπτουν στο ίδιο δομικό μοτίβο, το οποίο αποτελείται από 2 περιοχές σχήματος V, με 5 διαμεμβρανικά τμήματα η καθεμία, συνυφασμένες σε μια αντιπαράλληλη διευθέτηση. Η μελέτη αυτή (Vangelatos et al. 2009) παρείχε ενδείξεις ότι η θέση δέσμευσης των αμινοξικών καταλοίπων βρίσκεται στην περιοχή που σχηματίζεται λόγω του «ξεδιπλώματος» δύο θραυσμένων ελίκων στα TMS1 και ΤΜS6, οι οποίες και επιβεβαιώθηκαν (Gournas et al., 2015). Επιπλέον, επέτρεψε την πρόβλεψη αμινοξικών καταλοίπων που εμπλέκονται στην εξειδίκευση των ΥΑΤ μεταφορέων και παρουσιάζει στοιχεία που αφορούν αμινοξικά κατάλοιπα που εμπλέκονται στη σταθεροποίηση τους και στην πορεία τους προς την πλασματική μεμβράνη (Gournas et al., 2015). Παράλληλα, έχουμε ταυτοποιήσει trans-παράγοντες που επηρεάζουν τη λειτουργία των μεταφορέων PrnB και AgtA (Erpapazoglou et al., 2006; Roumelioti et al. 2009; Apostolaki et al. 2012).

Κατευθύνσεις:

Α.1. Διερεύνηση των μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης μεταφορέων αμινοξέων-νευροδιαβιβαστών (προλίνης και γλουταμικού) της APC υπεροικογένειας σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο.

Α.2. Απομόνωση και χαρακτηρισμός πρωτεϊνών που ρυθμίζουν άμεσα ή έμμεσα τη σύνθεση και τη λειτουργία μεταφορέων αμινοξέων-νευροδιαβιβαστών. Μελέτη μηχανισμών ενδοκύτωσης, υποκυτταρικής στόχευσης και ανακύκλωσης: CKI κινάσες, ένζυμα μεταβολισμού του άνθρακα, πρωτεΐνες του ενδοπλασματικού δικτύου.

Α.3. Διερεύνηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας-εξειδίκευσης μεταφορέων αμινοξέων-νευροδιαβιβαστών μέσω γενετικών, μοριακών, κυτταρικών και βιουπολογιστικών προσεγγίσεων.

A4. Μελέτη της εξέλιξης των μεταφορέων αμινοξέων στο γένος Aspergillus

Α.5 Χρήση του μύκητα A. nidulans ως πρότυπο μικροβιακό σύστημα για την ετερόλογη έκφραση και τη μελέτη των σχέσεων δομής-λειτουργίας μεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων της οικογένειας NAT (Νucleobase Αscorbate Τransporters) από τα φυτά και τον άνθρωπο.

Μεσοπρόθεσμοι και μακροπρόθεσμοι στόχοι:

Κατανόηση της αιτιολογίας δυσλειτουργίας μεταφορέων-νευροδιαβιβαστών σε νευροεκφυλιστικές κυρίως νόσους, δηλ. κατανόηση της μοριακής βάσης των ασθενειών αυτών. Πιθανός εντοπισμός νέων φαρμακολογικών στόχων και φαρμάκων υψηλής στόχευσης που θα μπορούσαν να βοηθήσουν σε νέες προσεγγίσεις θεραπείας.

 

Η πρωτεΐνη του ενδοπλασματικού δικτύου ShrA, η αλδολάση FbaA και η κινάση CkiA, παράγοντες στόχευσης στην πλασματική μεμβράνη APC μεταφορέων αμινοξέων, σημασμένες με GFP.

Βασικός πυρήνας δομής του μεταφορέα PrnB (της υπεροικογένειας APC) όπως προκύπτει από μοντελοποίηση με βάση την κρυσταλλική δομή του LeuT μεταφορέα λευκίνης του Aquifex aeolicus της οικογένειας NSS (Vangelatos et al., 2009). Ο μεταφορέας PrnB παρουσιάζεται με πράσινο χρώμα ενώ ο μεταφορέας LeuT με κόκκινο χρώμα. Το μοντέλο τοπολογίας δείχνει την αντίστροφη ψευδοσυμμετρική ενδομοριακή οργάνωση (internally inverted repeat V/Λ) μεταξύ των δεσμίδων ελίκων TM1-5 και TM6-10, το σχηματισμό του κέντρου δέσμευσης προλίνης μεταξύ των δύο ενδιαμέσων ενδομεμβρανικών θηλειών που διακόπτουν τη συνέχεια των ελίκων TM1 και TM6 (1a+1b, 6a+6b), αλλά και τη συμμετοχή των TM3 και TM8 στο ενεργό κέντρο δέσμευσης. Κατάλοιπα που προβλέπονται ως σημαντικά είτε στις 4 έλικες του κέντρου δέσμευσης (binding) είτε στις εξωτερικές θηλειές (L2, L8) που πιθανόν συνεισφέρουν στην ελεγχόμενη είσοδο-έξοδο υποστρώματος (gating) σημειώνονται με αστερίσκους.

Left: Interactions of APCs with amino acid substrates: the PrnB paradigm. Super-imposition of the LeuT (red line) and PrnB (green line) structures and predicted interactions with proline. Right: Substrate interacting residues are shown in sticks representation for LeuT and ball and sticks representation for PrnB. Residues taken from the X-ray structure of LeuT (rcsb code: 2A65) are underlined.

B. Μελέτη των μοριακών μηχανισμών πλευρικής διαμερισματοποίησης της πλασματικής μεμβράνης μυκήτων

Η κυτταρική μεμβράνη και οι λειτουργίες της είναι στοιχεία απαραίτητα για τη διατήρηση της ζωής. Η τελευταία θεώρηση γύρω από την οργάνωση της κυτταρικής μεμβράνης έχει μετατοπιστεί από το μοντέλο του ρευστού μωσαϊκού (Singer and Nicolson, 1972) προς τη σαφή διαμερισματοποίηση των λειτουργιών της σε λιπιδικές σχεδίες (Simons and Ikonen, 1997). Στο ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, η ύπαρξη μεμβρανικών νανοπεριοχών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη υποστηρίχθηκε από το στικτό πρότυπο κατανομής ορισμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών στην περιφέρεια του κυττάρου. Μία από αυτές τις περιοχές είναι η MCC (Membrane Compartment of Can1), στην οποία εντοπίζεται ο μεταφορέας αργινίνης Can1, ο οποίος κάτω από φυσιολογικές συνθήκες έχει στικτή κατανομή στη μεμβράνη του κυττάρου (Young et al., 2002; Malinska et al., 2003). Η δομική συγκρότηση της MCC περιοχής οφείλεται σε σταθερές πρωτεϊνικές υπομεμβρανικές, περιοχές, τα εισοσώματα (Walther et al., 2006; Douglas et al, 2011). Στο S. cerevisiae τα εισοσώματα αποτελούνται από τις κυτταροπλασματικές BAR-domain πρωτεΐνες Pil1p και Lsp1p (Strádalová et al. 2009) που δημιουργούν αυλακοειδείς νανο-εγκολπώσεις στη μεμβράνη, και τη διαμεμβρανική Sur7. Η συγκρότηση των εισοσωμάτων ρυθμίζεται από τα επίπεδα των σφιγγολιπιδίων, μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών Nce102p, Pkh1/2p και Ypk1p (Olivera-Couto and Aguilar, 2012).

Στο εργαστήριο δείξαμε ότι οι ειδικές εισοσωμικές πρωτεΐνες είναι συντηρημένες σε όλους τους ασκομύκητες και πιθανά στους βασιδιομύκητες (Scazzocchio et al., 2011; Scazzocchio and Sophianopoulou, μη δημοσιευμένα αποτελέσματα). Όμως παρά την εξελικτικά εντυπωσιακή συντήρησή τους οι μέχρι τώρα λειτουργίες που τους έχουν αποδοθεί (ρύθμιση της ενδοκύτωσης, σηματοδότηση μέσω βιοσύνθεσης σφιγγολιπιδίων, σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, οργάνωση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ζωής) δεν αποτελούν τη βασική λειτουργία τους (Fröhlich et al., 2009; Scazzocchio et al. 2011; Berchtold et al., 2012; Colabardini et al., 2013). Η συμβολή του εργαστηρίου μας προς την κατεύθυνση της διερεύνησης του βιολογικού ρόλου των εισοσωμικών πρωτεϊνών, προσεγγίζεται με την ταυτοποίηση, κλωνοποίηση και τη μελέτη των ομόλογων PilA, PilB, SurG και Nce102εισοσωμικών πρωτεϊνών στον ασκομύκητα A. nidulans. Σε αυτό το μύκητα που ανήκει στα Pezizomycotina, σε αντίθεση με τα Saccharomycotina, οι εισοσωμικές πρωτεΐνες ρυθμίζονται εξελικτικά έχοντας διαφορετική κατανομή σε μυκήλια και σπόρια (κονιδιοσπόρια και ασκοσπόρια) και δεν απαντώνται στα κύτταρα hülle (Vangelatos et al., 2010, Scazzocchio et al., 2011, Athanasopoulos et al., 2013). Η PilA είναι μια πρωτεΐνη που περιέχει το ημισεληνοειδές BAR-domain (Geranios 2014, ΜΔΕ, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ) και συμμετέχει στη σηματοδότηση της βιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων (Athanasopoulos et al., 2013). Η ορθόλογη της πρωτεΐνης Νce102p στον A. nidulans συνεντοπίζεται με τα εισοσώματα και διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη σταθερότητα/αριθμό των κοκκιωδών PilA και SurG στικτών σχηματισμών στην κεφαλή των νεαρών υφών του μύκητα (Athanasopoulos et al., 2015 under revision). Επιπλέον δείξαμε ότι οι PilA και AnNce102 πρωτεΐνες ρυθμίζουν αρνητικά τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων σε υψηλές θερμοκρασίες (Athanasopoulos et al., 2015 under revision).

Κατευθύνσεις:

Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαμερισματοποίηση της κυτταροπλασματκής μεμβράνης μυκήτων και διερεύνηση του βιολογικού τους ρόλου στον Aspergillus nidulans

Β1.Ταυτοποίηση, μοριακός και κυτταρικός χαρακτηρισμός, των κύριων εισοσωμικών πρωτεϊνών και των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στη συγκρότηση τους. Μελέτες σε διαφορετικές αναπτυξιακές δομές του αγενή και εγγενή κύκλου ζωής του μύκητα A. nidulans.

B2. Διερεύνηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας των εισοσωμικών πρωτεϊνών

Β3. Διερεύνηση του ρόλου των εισοσωμάτων σε θεμελιώδεις κυτταρικές λειτουργίες (τοπογένεση μεταφορέων, μεταγωγή σήματος, βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, οξειδωτικό στρες κλπ).

 

Μεσοπρόθεσμοι και μακροπρόθεσμοι στόχοι:

Εισοσωμικές πρωτεΐνες στα κονιδιοσπόρια και τα ασκοσπόρια του Aspergillus nidulans.

Διδακτορικές Διατριβές

 

Μεταπτυχιακά Διπλώματα Ειδίκευσης