payday loans
 

NCSR Demokritos

  • Increase font size
  • Default font size
  • Decrease font size

Μοριακής Γενετικής Εντόμων και Βιοτεχνολογίας

E-mail Εκτύπωση PDF
Ερευνητικό Έργο: Μοριακή Γενετική Εντόμων και Βιοτεχνολογία

Επιστημονικό Προσωπικό

Luc Swevers, Ερευνητής Α΄

Βασιλική Λαμπροπούλου, Ερευνήτρια B΄

Κώστας Ιατρού, Ομότιμος Ερευνητής Α΄

Παναγιώτα Τσίτουρα, Μεταδιδακτορική Συνεργάτις

Αριστείδης Ζωγραφίδης, Μεταδιδακτορικός Συνεργάτης

Νάντια Σδράλια, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια

Κωνσταντίνος Ιωαννίδης, Μεταπτυχιακός Φοιτητής

Άννα Κολλιοπούλου, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια

Δήμητρα Στεφάνου, Ειδική Τεχνική Επιστήμων

Χρήστος Μεριστούδης, Ειδικός Τεχνικός Επιστήμων

Δημήτρης Κοπανέλης, Τεχνικός (συνταξιούχος)

bi2_b
Ερευνητικά Ενδιαφέροντα
  1. 1. Ρυθμιστικοί μηχανισμοί για τον έλεγχο φυσιολογικών λειτουργιών των εντόμων.
    1. Η ωογένεση στα λεπιδόπτερα έντομα: ένα πρότυπο πρόγραμμα διαφοροποίησης που επάγεται από εκδυστεροειδείς ορμόνες.
    2. Μηχανισμοί ανοσοκαταστολής στα λεπιδόπτερα έντομα έπειτα από παρασιτισμό τους με υμενόπτερα ενδοπαρασιτοειδή: ο ρόλος των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών που προέρχονται από ενδοσυμβιωτικούς ιούς των υμενόπτερων και από τα αιμοκύτταρα των λεπιδόπτερων ξενιστών.
    3. Μηχανισμοί ελέγχου της οσφρητικής λειτουργίας στο κουνούπι-φορέα της ελονοσίας Anopheles gambiae.
    4. Ανάλυση των μονοπατιών των μικρών μορίων RNA (miRNA, siRNA) σε λεπιδόπτερα έντομα.
    5. Ανάλυση της αντι-ιικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι μόλυνσης από RNA ιούς σε λεπιδόπτερα έντομα: μικρά μόρια RNA και «κυτοκίνες».
  1. 2. Μοριακή βιολογία και γενετική μηχανική εντομοπαθογόνων ιών.
    1. Ιοί που εκφράζουν πρωτεΐνες τοξικές για τα έντομα-ξενιστές.
    2. Γενετικά τροποποιημένοι βακουλοϊοί ως φορείς για γενετικό μετασχηματισμό εντόμων.
    3. Γενετικά τροποποιημένοι βακουλοϊοί ως φορείς για γονιδιακή θεραπεία και εφαρμογές κυτταρικής ανοσοποίησης.
    4. Γενετικά τροποποιημένοι RNA ιοί με στόχο την επιτυχή μεταφορά μορίων ενεργοποίησης του RNAi μηχανισμού.
  1. 3. Λειτουργική γονιδιωματική.
    1. Συστήματα για την παραγωγή πρωτεϊνών οικονομικής σημασίας σε κυτταρικές σειρές λεπιδόπτερων εντόμων και θηλαστικών.
    2. Συστήματα ταχείας σάρωσης για την ανίχνευση βιοδραστικών ουσιών (ενεργοποιητών και αναστολέων φαρμακολογικών στόχων) σε χημικές βιβλιοθήκες και συλλογές φυσικών προϊόντων (φυτά και μικροοργανισμοί).
  1. 4. Διαχείριση πληθυσμών επιβλαβών εντόμων.
    1. Δοκιμές που βασίζονται στη χρήση κυτταρικών σειρών εντόμων για την ανίχνευση ενώσεων που επιταχύνουν την έκδυση (αγωνιστών εκδυσόνης): ανάπτυξη, σάρωση ταχείας απόδοσης και επαλήθευση σε δοκιμές τοξικότητας σε προνύμφες.
    2. Λειτουργική έκφραση και χαρακτηρισμός ενζύμων που παρουσιάζουν αποτοξινωτική δράση έναντι εντομοκτόνων.
    3. Δοκιμές σάρωσης για την ταυτοποίηση ουσιών από φυσικά εκχυλίσματα φυτών που δρουν ως συνεργιστές/σταθεροποιητές των εντομοκτόνων.
    4. Βιοτεχνολογικές μέθοδοι για την παραγωγή εντομοκτόνων που βασίζονται σε πρωτεΐνες: φορείς μεταφοράς τοξινών και dsRNA μορίων.
    5. Ανάπτυξη της μεθόδου RNAi ως εργαλείου για την αξιολόγηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας έναντι εντομοκτόνων σε προνύμφες εντόμων.

Συμμετοχή σε ερευνητικά έργα

1)    Bioinsecticides from Insect Parasitoids (BIP). 2001-2004. Ευρωπαϊκή Ένωση – 5ο Πρόγραμμα Πλαίσιο / FP5-QL Βασική Έρευνα (RTD). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Carla Malva.

2)    Τεχνητά Χρωμοσώματα Εντομοϊών (ΤΕΧΡΕΝ) και Τεχνολογίες για Γονιδιακή Θεραπεία και Συνεχή Υψηλού Επιπέδου Έκφραση Θεραπευτικών Πρωτεϊνών σε Εντομικά Συστήματα Παραγωγής. 2004-2007. ΓΓΕΤ Ερευνητικές Κοινοπραξίες (ΕΠΑΝ). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Κ. Ιατρού.

3)    Τεχνολογίες Υπερέκφρασης και Παραγωγής Ανασυνδυασμένων Πρωτεϊνών από Κλωνοποιημένα Γονίδια και Ανάπτυξη Τεχνολογιών και Εφαρμογών για Ταχεία Ανίχνευση Νέων Φαρμακολογικών Παραγόντων σε Φυσικά Προϊόντα. 2004-2005. ΓΓΕΤ ΠΡΑΞΕ – Φάση Α. Επιστημονικός Υπεύθυνος: Κ. Ιατρού.

4)    Endocrine and Paracrine Control Mechanisms of the Gonadal Ecdysteroid Response in Insects. 2004-2007. FWO – Vlaanderen G.0469.04 (Βέλγιο). Επιστημονικός Υπεύθυνος: J. Vanden Broeck.

5)    The olfactory odorant binding proteins of the malaria mosquito Anopheles gambiae as targets for vector control. 2004-2006. ΓΓΕΤ Διμερής Συνεργασία (Ελλάδα-ΗΠΑ). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Κ. Ιατρού.

6)     Ρυθμιστικοί μηχανισμοί που διέπουν την ωoγένεση στα Λεπιδόπτερα έντομα: χαρακτηρισμός και μελέτη μορίων με κομβικό ρόλο στα διαδοχικά στάδια της ωογένεσης του μεταξοσκώληκα Bombyx mori. 2006-2008. ΓΓΕΤ Βασική Έρευνα (ΠΕΝΕΔ). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Luc Swevers.

7) Γενετικά τροποποιημένες κυτταροσειρές εντόμων για ταχεία ανίχνευση μιμητικών εκδυστεροειδών  ορμονών με εξειδικευμένη εντομοκτόνο δράση σε συλλογές συνθετικών ουσιών. 2006-2008. ΓΓΕΤ Διμερής Συνεργασία (Ελλάδα-Ιαπωνία). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Luc Swevers.

8)     Περιβαλλοντικά φιλικός έλεγχος της αναρριχώμενης φυτοφάγου κάμπιας της Μεσογείου Spodoptera littoralis με εξειδικευμένους ορμονικούς καταστολείς. 2006-2008. ΓΓΕΤ Διμερής Συνεργασία (Ελλάδα-Ισπανία). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Luc Swevers.

9)     Key mechanisms of systemic RNA interference (RNAi) in insects. 2009-2012. FWO – Vlaanderen F 6/12 (Βέλγιο). Επιστημονικός Υπεύθυνος: G. Smagghe.

10)   ENAROMaTIC - European Network for Advanced Research on Olfaction for Malaria Transmitting Insect Control. 2008-2012. Ευρωπαϊκή Ένωση (EC FP7-HEALTH-2007-B- ερευνητικές κοινοπραξίες). Επιστημονικός Υπεύθυνος: Κ. Ιατρού.

11)   Γενωμική και λειτουργική προσέγγιση για την κατανόηση της ανθεκτικότητας εντόμων και ακάρεων στα εντομοκτόνα και την ανάπτυξη εφαρμογών για την αντιμετώπισή της. 2012-2015.

Υπουργείο Παιδείας, Δια Βίου Μάθησης και Θρησκευμάτων, Ειδική Υπηρεσία Διαχείρησης, Επιχειρησιακού Προγράμματος Εκπαίδευσης & Δια Βίου Μάθηση, Πρόγραμμα «ΘΑΛΗΣ». Επιστημονικός Υπεύθυνος: Ι. Βόντας.

12)   Virus-induced mechanisms regulating RNAi in insects. 2013-2016. FWO – Vlaanderen G028013N (Βέλγιο). Επιστημονικός Υπεύθυνος: G. Smagghe.

13)   «Νέες Προσεγγίσεις στο Μετασχηματισμό Εντόμων». 2013-2014. ΓΓΕΤ Διμερής Συνεργασία (Ελλάδα-Σλοβακία). Επιστημονικός Υπεύθυνος: L. Swevers.

Εξοπλισμός Εργαστηρίου

Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών εντόμων: επωαστικοί κλίβανοι, βιοαντιδραστήρας κυτταροκαλλιεργειών BIOWAVE, θάλαμος νηματικής ροής, ανάστροφο μικροσκόπιο, ανάστροφο μικροσκόπιο φθορισμού, ψυχόμενες μικροφυγόκεντροι, οσμόμετρο.

Μονάδες ανάπτυξης εντόμων: θάλαμος ανάπτυξης (μεταξοσκωλήκων).

Παραγωγή πρωτεϊνών: στήλες χρωματογραφίας συγγένειας, καθαρισμός αντισωμάτων, HPLC.

Βιοχημεία και Μοριακή Βιολογία: ηλεκτροφόρηση DNA, RNA και πρωτεϊνών, μικροφυγόκεντροι, συσκευή ηλεκτροδιάτρησης, συσκευή ηχοτριψίας, μικροφασματοφωτόμετρο (Nanodrop).

Συστήματα ταχείας ανίχνευσης βιοδραστικών μορίων: συσκευές ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης για φθορισμό/απορρόφηση (Galaxy) ή φθορισμό/φωταύγεια/απορρόφηση (Tecan) με βάση πρωτεΐνες όπως πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, ροδαμίνη, φλουορεσκίνη, β-γαλακτοσιδάση, λουσιφεράση και άλλες φωτοπρωτεΐνες.

Συνεργασίες

Δρ. Ι. Βόντας, ΙΤΕ – Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας, Ηράκλειο, Κρήτη.

Δρ. Α. Κούρτη, Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών.

Δρ. Ρ. Μάτσας, Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Αθήνα.

Δρ. Κ. Καλαντίδης, ΙΤΕ – Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας, Ηράκλειο, Κρήτη.

Δρ. Μ. Κωνσταντοπούλου, Χημική Οικολογία και Φυσικά Προϊόντα, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος», Αθήνα

Dr. G. Smagghe, Faculty of Bioscience Engineering, Ghent University, Belgium.

Dr. J. Vanden Broeck, Animal Physiology and Neurobiology, University of Leuven, Belgium.

Dr. Y. Nakagawa, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Japan.

Dr. D. Zitnan, Institute of Zoology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia.

Dr. D. Martin, Institute of Evolutionary Biology, Barcelona, Spain.

Dr. J. Sun, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou, People's Republic of China.

 

Πρόσφατη Πρόοδος:

Ρυθμιστικοί μηχανισμοί για τον έλεγχο φυσιολογικών λειτουργιών των εντόμων

Η απόκριση του RNAi μηχανισμού στο μεταξοσκώληκα, Bombyx mori

Η παρεμπόδιση μέσω RNA (RNA interference, RNAi) έχει πρόσφατα αναπτυχθεί ως μια ισχυρή τεχνική της ανάστροφης γενετικής για τη λειτουργική ανάλυση γονιδίων με πιθανή εφαρμογή στην καταπολέμηση των επιβλαβών εντόμων (3,13). Στο μεταξοσκώληκα, Β. mori (Λεπιδόπτερα), η έγχυση μορίων dsRNA ή η χορήγηση τροφής που περιέχει dsRNA δεν προκαλεί ισχυρή απόκριση του RNAi μηχανισμού (1). Η παρατήρηση αυτή μας ώθησε να αξιολογήσουμε ορισμένους παράγοντες που ενδεχομένως σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα του RNAi (ή την έλλειψη αυτής) στο μεταξοσκώληκα, όπως:

Πρότυπα έκφρασης των βασικών ενδοκυτταρικών παραγόντων του RNAi μηχανισμού

Μελέτες έκφρασης έδειξαν ότι η απουσία έκφρασης του R2D2, ενός βασικού συμπαράγοντα των Dicer-2 και Ago-2, ενδέχεται να παίζει κάποιο ρόλο στην περιορισμένη συστημική απόκριση του RNAi μηχανισμού που παρατηρείται στον Bombyx (2). Ωστόσο, λειτουργικές μελέτες δείχνουν ότι ο ενδοκυτταρικός μηχανισμός του RNAi μπορεί να λειτουργήσει αποτελεσματικά απουσία του R2D2 στα κύτταρα Bm5, μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από το μεταξοσκώληκα (5).

Έκφραση ενζύμων αποικοδόμησης του dsRNA

Αποδείχθηκε ότι μια μη ειδική DNA/RNA νουκλεάση («dsRNase») εκφράζεται ευρέως σε πολλούς διαφορετικούς ιστούς, και είναι ικανή τόσο να αποικοδομεί το dsRNA ενδοκυτταρικά, όσο και να παρεμβαίνει στο dsRNA-εξαρτώμενο μηχανισμό πρόκλησης γονιδιακής αποσιώπησης (4).

Το dsRNA ως (μη-ειδικό) "παθογονο-συνδεόμενο μοριακό μοτίβο" (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)

Παρατηρήθηκε ότι η έγχυση dsRNA στην αιμολέμφο των προνυμφών του Bombyx επάγει την έκφραση γονιδίων του RNAi μηχανισμού (Dicer-2, Ago-2) και του γονιδίου dsRNase στο μεσέντερο, ενώ η έκφραση του γονιδίου του υποδοχέα Toll9-1 της φυσικής ανοσίας παρεμποδίζεται (6). Η εκτοπική έκφραση του υποδοχέα Toll9-1 σε κύτταρα Bm5 παρατηρήθηκε ότι ρυθμίζει την απόκριση έναντι των PAMPs (δηλαδή του dsRNA και του λιποπολυσακχαρίτη (LPS)) όσον αφορά στην έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στον RNAi μηχανισμό και τη φυσική ανοσία (12).

Εμμένουσα μόλυνση από RNA ιoύς

Υπήρξε η υπόθεση ότι μια εμμένουσα ιϊκή μόλυνση μπορεί να επηρεάσει σοβαρά τη λειτουργία του RNAi μηχανισμού, με τη βοήθεια πολλών διαφορετικών μοριακών μηχανισμών (8). Βασιζόμενοι στο εύρημα ότι το στέλεχος Daizo του Bombyx βρίσκεται σε κατάσταση εμμένουσας μόλυνσης από τον κυτταροπλασματικό πολυεδρικό ιό (cytoplasmic polyhedrosis virus, CPV), ο οποίος χαρακτηρίζεται από ένα τμηματικό γονιδίωμα dsRNA (Cypovirus, Reoviridae), αποφασίστηκε να διερευνηθεί κατά πόσο η εμμένουσα μόλυνση μπορεί να επηρεάσει την ανοσολογική απόκριση (συμπεριλαμβανομένου του μηχανισμού RNAi) έναντι της παθογόνου μόλυνσης από τον ίδιο ιό. Η ανάλυση με την τεχνολογία της αλληλούχισης RNA νέας γενιάς (RNA next generation sequencing) αποκαλύπτει μια μοναδική απόκριση του μεταξοσκώληκα στη μόλυνση από τον dsRNA ιό, χωρίς αυτή να επικαλύπτεται από τα κλασσικά μονοπάτια φυσικής ανοσίας που ενεργοποιούνται από βακτήρια ή μύκητες (15). Πιο συγκεκριμένα, η ανάλυση του συνόλου των μεταγράφων (transcriptome) αποκαλύπτει μια σύνθετη απόκριση στην παθογόνο μόλυνση από τον BmCPV, η οποία περιλαμβάνει διαφορική έκφραση γονιδίων που ανήκουν σε κατηγορίες σχετιζόμενες με φυσικά εμπόδια, ανοσοαπόκριση, πρωτεολυτικά/μεταβολικά ένζυμα, πρωτεΐνες θερμικού σοκ, ορμονική σηματοδότηση και μη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες (15). Η ανάλυση των μικρών μορίων RNA του ιού (viral small RNAs, vsRNAs) δείχνει μια σαφή ενεργοποίηση της απόκρισης του RNAi μηχανισμού στις προνύμφες έναντι της μόλυνσης από τον BmCPV, είτε πρόκειται για εμμένουσα είτε για παθογόνο μόλυνση (15). Η επαγωγή απόκρισης του RNAi μηχανισμού, όπως υποδεικνύεται από τα ποσά των παρατηρούμενων ιικών μικρών μορίων RNA, μπορεί να συσχετιστεί με την σοβαρότητα της ιικής μόλυνσης (εμμένουσα έναντι παθογόνου). Έχει ενδιαφέρον ότι η προϋπάρχουσα εμμένουσα μόλυνση δεν φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά τη μετέπειτα ανοσολογική απόκριση στην παθογόνο μόλυνση (σύγκριση με τα δεδομένα από τη βιβλιογραφία).

Επισκόπηση της έρευνας RNAi σε έντομα.

Δημοσιεύσεις:

1. Terenius, O., Papanicolaou, A., Garbutt, J.S., Eleftherianos, I., Huvenne, H., Sriramana, K., Albrechtsen, M., An, C., Aymeric, J.-L., Barthel, A., Bebas, P., Bitra, K., Bravo, A., Chevalier, F., Collinge, D.P., Crava, C.M., de Maagd, R.A., Duvic, B., Erlandson, M., Faye, I., Felföldi, G., Fujiwara, H., Futahashi, R., Gandhe, A.S., Gatehouse, H.S., Gatehouse, L.N., Giebultowicz, J., Gómez, I., Grimmelikhuijzen, C.J., Groot, A.T., Hauser, F., Heckel, D.G., Hegedus, D.D., Hrycaj, S., Huang, L., Hull, J., Iatrou, K., Iga, M., Kanost, M.R., Kotwica, J., Li, C., Li, J., Liu, J., Lundmark, M., Matsumoto, S., Meyering-Vos, M., Millichap, P.J., Monteiro, A., Mrinal, N., Niimi, T., Nowara, D., Ohnishi, A., Oostra, V., Ozaki, K., Papakonstantinou, M., Popadic, A., Rajam, M.V., Saenko, S., Simpson, R.M., Soberón, M., Strand, M.R., Tomita, S., Toprak, U., Wang, P., Wee, C.W., Whyard, S., Zhang, W., Nagaraju, J., ffrench-Constant, R.H., Herrero, S., Gordon, K., Swevers, L., and Smagghe, G. (2011). RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect Physiol. 57, 231-245.

2. Swevers, L., Liu, J., Huvenne, H., and Smagghe, G. (2011). Search for limiting factors in the RNAi pathway in silkmoth tissues and Bm5 cells: the RNA-binding proteins R2D2 and Translin. PLoS ONE 6:e20250.

3. Swevers, L. and Smagghe, G. (2012). Use of RNAi for control of insect crop pests. In:” Arthropod-Plant Interactions, Novel Insights and Approaches for IPM”, Progress in Biological Control, Volume 14. G. Smagghe & I. Diaz (Eds.), pp 177-197. Springer-Verlag, Dordrecht.

4. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., and Smagghe, G. (2012). Bombyx mori DNA/RNA non-specific nuclease isoforms: expression in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J. Insect Physiol. 58, 1166-1176.

5. Kolliopoulou, A., and Swevers, L. (2013). Functional analysis of the RNAi response in ovary-derived silkmoth Bm5 cells. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 654-663.

6. Liu, J., Smagghe, G., and Swevers, L. (2013). Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654.

7. Kontogiannatos, D., Swevers, L., Maenaka, K., Park, E.Y., Iatrou, K., and Kourti, A. (2013). Functional Characterization of a Juvenile Hormone Esterase Related Gene in the Moth Sesamia nonagrioides through RNA Interference. PLoS ONE 8, e73834.

8. Swevers, L., Vanden Broeck, J., and Smagghe, G. (2013). The possible impact of persistent virus infection on the function of the RNAi machinery in insects: a hypothesis. Frontiers in Physiology 4, Article 319.

9. Swevers, L., Huvenne, H., Menschaert, G., Kontogiannatos, D., Kourti, A., Pauchet, Y., ffrench-Constant, R., and Smagghe, G. (2013). Colorado potato beetle (Coleoptera) gut transcriptome analysis: expression of RNA interference-related genes. Insect Mol. Biol. 22, 668-684.

10. Christiaens, O., Swevers, L., and Smagghe, G. (2014). DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides 53 (2014) 307–314.

11. Swevers, L., Kolliopoulou, A., Li, Z., Daskalaki, M., Verret, F., Kalantidis, K., Smagghe, G., and Sun, J. (2014). Transfection of BmCPV genomic dsRNA in silkmoth-derived Bm5 cells: Stability and interactions with the core RNAi machinery. J. Insect Physiol. 64 (2014) 21–29.

12. Liu, J., Kolliopoulou, A., Smagghe, G., and Swevers, L. (2014). Modulation of the transcriptional response of innate immune and RNAi genes upon exposure to dsRNA and LPS in silkmoth-derived Bm5 cells overexpressing BmToll9-1 receptor. J. Insect Physiol. 66 (2014) 10–19.

13. Smagghe, G., and Swevers, L. (2014). Editorial overview: Pests and resistance – RNAi research in insects. Current Opinion in Insect Science 6, iv-v.

14. Kolliopoulou, A., and Swevers, L. (2014). Recent progress in RNAi research in Lepidoptera: intracellular machinery, antiviral immune response and prospects for insect pest control. Current Opinion in Insect Science 6, 28-34.

15) Kolliopoulou, A., Van Nieuwerburgh, F., Stravopodis, D.J., Deforce, D., Swevers, L., and Smagghe, G. (2015). Transcriptome analysis of Bombyx larval midgut during persistent and pathogenic cytoplasmic polyhedrosis virus infection. Submitted for publication.

 

Bιο-εντομοκτόνα για την προστασία των καλλιεργειών - παρασιτικές σφήκες

Παρασιτισμός λεπιδοπτέρων εντόμων από παρασιτοειδή υμενόπτερα

Για τον επιτυχή παρασιτισμό των προνυμφών Manduca sexta από την ενδοπαρασιτική σφήκα Cotesia congregata μαζί με τον ενδοσυμβιωτικό ιό, Cotesia congregata Bracovirus (CcBV),η έκφραση των πρωτεϊνών του ιού είναι απαραίτητη για την επιτυχή παρασιτισμό από τη  σφήκα. Οι ιοί Bracoviruses (ή PDV), είναι μια ομάδα που προέρχονται από τους Nudiviruses και είναι ιοί συγγενείς προς τους βακουλοϊούς.

Απόκριση της έμφυτης ανοσίας των λεπιδοπτέρων

Για τη μελέτη των μηχανισμών της ανοσοκαταστολής λεπιδοπτέρων εντόμων μετά παρασιτισμό από υμενόπτερα (endoparasitoids), εκφράστηκαν πρωτεΐνες του ιού CcBV και διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις τους με πρωτεΐνες των αιμοκυττάρων του ξενιστή (Manduca sexta). Βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη CcV1, του ιού, αλληλεπιδρά με μόρια της χυμικής ανοσίας ενώ έχει επίδραση και στην κυτταρική ανοσία του ξενιστή (1,2,3,4).

Τα μονοπάτια Imd και Toll αναστέλλονται διαφορικά από τις πρωτεΐνες Ank του ιού CcBV, σε κύτταρα λεπιδόπτερων εντόμων

Μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες του ιού (CcBV) είναι η οικογένεια με επαναλήψεις ανκυρίνης, η οποία είναι ομόλογη με τα IκBa μόρια των θηλαστικών. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει εννέα μέλη Ank1- 9 και πιστεύεται ότι παρεμβαίνει στην επαγόμενη έμφυτη ανοσολογική απόκριση του ξενιστή. Προσαρμόζοντας δοκιμασίες μεταγραφής γονιδίων σε κύτταρα λεπιδόπτερων εντόμων, διαπιστώθηκε ότι οι Αnk πρωτεΐνες του ιού CcBV παρουσιάζουν διαφορική αναστολή των μεταγραφικών παραγόντων τύπου NFκB, όπως Relish1- d2, RelΑ και RelB, μεταγραφικών παραγόντων του Bombyx mori. Τόσο η λειτουργική όσο και η υποκυτταρική κατανομή της έκφρασης των Αnk πρωτεϊνών υποδηλώνει διαφορές μεταξύ των μελών της αυτής οικογένειας (5).

 

Δημοσιεύσεις:

  1. Lapointe R, Wilson R, Vilaplana L, O'Reilly DR, Falabella P, Douris V, Bernier-Cardou M, Pennacchio F, Iatrou K, Malva C, Olszewski JA. Expression of a Toxoneuron nigriceps polydnavirus-encoded protein causes apoptosis-like programmed cell death in lepidopteran insect cells. J Gen Virol. 2005, 86:963-71.
  2. Espagne E, Douris V, Lalmanach G, Provost B, Cattolico L, Lesobre J, Kurata S, Iatrou K, Drezen JM, Huguet E. A virus essential for insect host-parasite interactions encodes cystatins.J Virol. 2005, 79: 9765-76.
  3. Douris V, Swevers, L, Labropoulou V, Andronopoulou E, Georgoussi Z. and Iatrou  K. Stably transformed insect cell lines: tools for expression of secreted and membrane-anchored proteins and high throughput screening platforms for drug and insecticide discovery. Adv. in Virus Res., 2006, 68: 113-156.
  4. Labropoulou V, Douris V, Stefanou D, Magrioti C, Swevers L, and Iatrou K. Endoparasitoid wasp bracovirus-mediated inhibition of hemolin function and lepidopteran host immunosuppression. Cell. Microbiol. 2008, 10: 2118-28.
  5. Magkrioti C, Iatrou K. and Labropoulou V.  Differential inhibition of BmRelish1-dependent transcription in lepidopteran cells by bracovirus ankyrin-repeat proteins. Insect Biochem Mol Biol 2011, 12: 993-1002.

Μοριακή βιολογία και γενετική μηχανική ιών εντόμων

Γενετικά τροποποιημένοι βακουλοϊοί ως φορείς για γονιδιακή θεραπεία και εφαρμογές κυτταρικής ανοσοποίησης

Οι Βακουλοϊοί, μια ομάδα ιών εντόμων με μεγάλο γονιδίωμα δίκλωνου DNA, έχουν αρκετές  ιδιότητες που τους καθιστούν ιδιαίτερα κατάλληλους για την ανάπτυξη φορέων γονιδιακής μεταγωγής, όπως το μεγάλο μέγεθος του γονιδιώματός τους, η ικανότητα να εισέρχονται σε κύτταρα με ένα μη ειδικό μηχανισμό και η έλλειψη τοξικότητας. Προσπάθειες για την ανάπτυξη βακουλοϊοών ως φορείς γονιδιακής μεταγωγής έχουν πραγματοποιηθεί τόσο για κύτταρα θηλαστικών όσο και για κύτταρα εντόμων.

Φορείς μεταγωγής που στοχεύουν κύτταρα των θηλαστικών

Φορείς βακουλοϊών με κασέτες έκφρασης θηλαστικών κατασκευάστηκαν για την έκφραση της  GFP όπως και θεραπευτικών πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών και σε πρωτογενή κύτταρα Schwann (1,4). Πιο συγκεκριμένα, η μεταγωγή της πρωτεΐνης προσκόλλησης L1, μέσω φορέων βακουλοϊου, βρέθηκε να προκαλεί φυσιολογικές αποκρίσεις σε κύτταρα Schwann σε ex vivo πειράματα, με πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές (4). Εκτός από τους φορείς που δημιουργήθηκαν από γονιδίωματα βακουλοϊών άγριου τύπου, εναλλακτικά έχουν επίσης αναπτυχθεί φορείς ελλειματικοί στο βασικό γονίδιο ie1, που εμφανίζουν μειωμένη έκφραση ενδογενών ιικών γονιδίων στα μεταγμένα  κύτταρα θηλαστικών (3), και συνεπώς χαρακτηρίζονται  ως πιο ασφαλείς.

Φορείς μεταγωγής για μετασχηματισμό εντόμων

Μία παρόμοια στρατηγική οδήγησε στην κατασκευή φορέων βακουλοϊών με κασέτες έκφρασης εντόμων. Τέτοιοι φορείς χρησιμοποιήθηκαν για να επάγουν RNAi στο λεπιδόπτερο Sesamia nonagrioides μέσω της έκφρασης κασετών φουρκέτας RNA (5). Πιο πρόσφατα, η έρευνα επικεντρώθηκε στην παραγωγή φορέων βακουλοϊού που είναι ελλειματικοί σε βασικά γονίδια, όπως το lef8, το οποίο κωδικοποιεί μία υπομονάδα της ιικής RNA πολυμεράσης (6), και ie1, το οποίο κωδικοποιεί τον κύριο ρυθμιστή του κύκλου της ιικής μόλυνσης. Τέλος, δημιουργήθηκαν φορείς βακουλοϊού που ενσωματώνουν το σύστημα μεταφοράς PiggyBac (βασισμένοι είτε σε άγριου-τύπου  είτε σε ελλειματικό γονιδίωμα του ιού) με στόχο την ανάπτυξη μιας νέας, εύκολα εφαρμόσιμης μεθόδου μετασχηματισμού των εντόμων. Υβριδικοί φορείς βακουλοϊού-PiggyBac πρόκειται να δοκιμαστούν στον οργανισμό-μοντέλο για τα λεπιδόπτερα Bombyx mori.

Μεταγωγή των κυττάρων Schwann με φορείς βακουλοϊού ( ex νίνο).

 

Δημοσιεύσεις:

1. Iatrou, K., and Swevers, L. (2005). Transformed lepidopteran cells expressing a protein of the silkmoth fat body display enhanced susceptibility to baculovirus infection and produce high titers of budded virus in serum-free media. J. Biotech. 120, 237-250.

2. Kenoutis, C., Efrose, R. C., Swevers, L., Lavdas, A.A., Gaitanou, M., Matsas, R., and Iatrou, K. (2006). Baculovirus-mediated gene delivery into Mammalian cells does not alter their transcriptional and differentiating potential but is accompanied by early viral gene expression. J Virol. 80, 4135-4146.

3. Efrose, R., Swevers, L., and Iatrou, K. (2010). Baculoviruses deficient in ie1 gene function abrogate viral gene expression in transduced mammalian cells. Virology 406, 293-301.

4. Lavdas, A.A., Efrose, R., Douris, V., Gaitanou, M., Papastefanaki, F., Swevers, L., Thomaidou, D., Iatrou, K., and Matsas, R. (2010). Soluble forms of the cell adhesion molecule L1 produced by insect and baculovirus-transduced mammalian cells enhance Schwann cell motility. J. Neurochem. 115, 1137-1149.

5. Kontogiannatos, D., Swevers, L., Maenaka, K., Park, E.Y., Iatrou, K., and Kourti, A. (2013). Functional Characterization of a Juvenile Hormone Esterase Related Gene in the Moth Sesamia nonagrioides through RNA Interference. PLoS ONE 8, e73834.

6. Ioannidis, K., Swevers, L., and Iatrou, K. (2015). The lef8 gene of BmNPV: effects of deletion and implications for gene transduction applications. Submitted for publication.

Διαχείριση πληθυσμών επιβλαβών εντόμων

Ενώσεις που επιταχύνουν την έκδυση (molting accelerating compounds, MACs) ή αγωνιστές εκδυσόνης

Οι ενώσεις MAC ενεργούν ως εντομοκτόνα προκαλώντας μια πρόωρη, θανατηφόρο έκδυση στα έντομα-στόχους. Επειδή οι ενώσεις MAC μπορούν να επάγουν την έκδυση σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις σε σύγκριση με τη φυσική ορμόνη, την 20-υδροξυ-εκδυσόνη (20Ε), και δεν αποβάλλονται αποτελεσματικά από το σώμα του εντόμου, το έντομο παραμένει εγκλωβισμένο στη διαδικασία της έκδυσης και πεθαίνει λόγω αφυδάτωσης και στέρησης τροφής.

Για την ανίχνευση των ενώσεων MAC αναπτύχθηκε ένα σύστημα που βασίζεται στην ενεργοποίηση ενός ευαίσθητου στην εκδυσόνη γονιδίου αναφοράς σε κυτταρικές σειρές εντόμων (1) και χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο μιας συλλογής από περισσότερες των 200 ενώσεων διβενζοϋλυδραζίνης (2). Η δραστικότητα των ενώσεων που αποδείχθηκαν πιο δραστικές κατά τη σάρωση αυτή επιβεβαιώθηκε σε δοκιμές τοξικότητας σε προνύμφες της φυτοφάγου κάμπιας της Μεσογείου, Spodoptera littoralis (3).

Συστήματα ανίχνευσης αγωνιστών εκδυσόνης ή ενώσεων MAC αναπτύχθηκαν για είδη που ανήκουν στα λεπιδόπτερα (3), τα δίπτερα (4), τα κολεόπτερα (5,6) και τα  οστρακόδερμα (7,8). Πρόσφατα παρατηρήθηκε ισχυρή δραστικότητα των ενώσεων διβενζοϋλυδραζίνης σε δοκιμές τοξικότητας έναντι προνυμφών του κουνουπιού που προκαλεί ελονοσία (Anopheles gambiae) (9).

Γενικό διάγραμμα για την σάρωση αγωνιστών ή ανταγωνιστών εκδυζόνης μέσω της χρήσης μετασχηματισμένων ή διαμολυσμένων κυτταρικών σειρών.

Δημοσιεύσεις:

1. Swevers, L., Kravariti, L., Ciolfi, S., Xenou-Kokoletsi, M., Ragoussis, N., Smagghe, G., Nakagawa, Y., Mazomenos, B., and Iatrou., K. (2004). A cell-based high-throughput screening system for detecting ecdysteroid agonists and antagonists in plant extracts and libraries of synthetic compounds. FASEB J. 18, 134-136. FASEB J. 10.1096/fj.03-0627fje.

2. Wheelock, C.E., Nakagawa, Y., Harada, T., Oikawa, N., Akamatsu, M., Smagghe, G., Stefanou, D., Iatrou, K., and Swevers, L. (2006). High-throughput screening of ecdysone agonists using a reporter gene assay followed by 3-D QSAR analysis of the molting hormonal activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 1143-1159.

3. Soin, T., De Geyter, E., Mosallanejad, H., Iga, M., Martín, D., Ozaki, S., Kitsuda, S., Harada, T., Miyagawa, H., Stefanou, D., Kotzia, G., Efrose, R., Labropoulou, V., Geelen, D., Iatrou, K., Nakagawa, Y., Janssen, C.R., Smagghe, G., and Swevers, L. (2010a). Assessment of species specificity of molting accelerating compounds in Lepidoptera: comparison of activity between Bombyx mori and Spodoptera littoralis by in vitro reporter and in vivo toxicity assays. Pest Management Science 66, 526–535.

4. Soin, T., Swevers, L., Kotzia, G., Iatrou, K., Janssen, C.R., Rougé, P., Harada, T., Nakagawa, Y., and Smagghe G (2010b). Comparison of the activity of non-steroidal ecdysone agonists between dipteran and lepidopteran insects, using cell-based EcR reporter assays. Pest Manag. Sci. 66, 1215-1229.

5. Soin, T., Masatoshi, I., Swevers, L., Rougé, P., Janssen, C.R., and Smagghe, G. (2009). Towards Coleoptera-specific high-throughput screening systems for compounds with ecdysone activity: development of EcR reporter assays using weevil (Anthonomus grandis)-derived cell lines and in silico analysis of ligand binding to A. grandis ligand-binding pocket. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 523-534.

6. Ogura, T., Nakagawa, Y., Swevers, L., Smagghe, G., and Miyagawa, H. (2012). Quantitative evaluation of the molting hormone activity in coleopteran cells established from the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Pesticide Biochemistry and Physiology 104, 1–8.

7. Verhaegen, Y., Parmentier, K., Swevers, L., Rougé, P., Soin, T., De Coen, W., Cooreman, K., and Smagghe, G. (2010). The brown shrimp (Crangon crangon L.) ecdysteroid receptor complex: Cloning, structural modeling of the ligand-binding domain and functional expression in an EcR-deficient Drosophila cell line. Gen. Comp. Endocr. 168, 415-423.

8. De Wilde, R., Swevers, L., Soin, T., Christiaens, O., Rougé, P., Cooreman, K., Janssen, C.R., and Smagghe, G. (2013). Cloning and functional analysis of the ecdysteroid receptor complex in the opossum shrimp Neomysis integer (Leach, 1814). Aquat. Toxicol. 130-131, 31-40.

9. Morou, E., Lirakis, M., Pavlidi, N., Zotti, M., Nakagawa, Y., Smagghe, G., Vontas, J., and Swevers, L. (2013). A new dibenzoylhydrazine with insecticidal activity against Anopheles mosquito larvae. Pest Manag. Sci. 69, 827–833.